厌氧菌的分离与鉴定

糖尿病皮肤病变

厌氧菌的分离与鉴定是对氧敏感度高的细菌进行分离与鉴别的试验，因为厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。用于有糖尿病，严重肝病，肝硬化，尿毒症，褥疮溃疡，肢体坏疽，肉毒中毒等症状的患者的诊断。

分离　　

1编号　　取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。　　

2稀释　　在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。　3滚管分离　　

1)滚管　　将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。　　

2)分离纯化　　生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。

　　在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下述事项。

　　(1)厌氧标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝，务必在30min内完成，同时应避免正常菌群的污染。

　　(2)培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。

　　(3)若菌落太小，需用放大镜观察菌落。

　　(4)做耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4～5个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。

　　(5)如做胞外酶鉴定，一定要有足够的菌液浓度。