B淋巴细胞表面标志

B淋巴细胞表面标志作用为估评个体体液免疫功能的一类检验。B细胞数量的降低与体液免疫缺陷有关，B细胞数升高则与B细胞恶性增生等有关。

(1)取肝素抗凝血2ml，加等量Hank液混匀，重层于分层液上，2000r/min，离心20min。取出淋巴细胞层，加Hank液，洗3次，1200r/min，离心10min，调整淋巴细胞浓度为1×107/ml，取0.1ml分装两管。　　

(2)将淋巴细胞悬液再用Hank液洗1次，弃去上清，用滤纸吸去管内壁剩余液体，分别加兔抗人IgG及抗人IgM荧光抗体2滴(约0.08ml)，轻摇后，放37℃温箱30min。　　

(3)从温箱取出用Hank液洗两次，1000r/min离心10min，小心吸去全部上清，将管底沉淀的细胞加入50% PBS缓冲甘油1滴，混匀后取1滴加入载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察

　　(1)荧光抗体试剂中存在凝聚IgG的影响，凝聚IgG可以和B细胞表面Fc受体结合出现假阳性，因此，为避免出现凝聚IgG须注意：

　　①不能使用F/P克分子比值过高的荧光抗体，一般以1～3为宜。

　　②含低浓度蛋白的荧光抗体低温保存不稳定，一般不应低于2mg/ml。

　　③低温保存的荧光抗体不可反复冻融，使用前150000r/min离心30min，除去凝聚物。

　　(2)活的淋巴细胞作免疫荧光染色时，在全部试剂中(标记抗体、Hank液等)均需加NaN3，以限制细胞膜的流动性。否则会出现帽状荧光和吞噬现象，荧光细胞实际数下降。

　　(3)用抗IgG荧光抗体染色时，可由于标本中含有抗原一抗体(IgG型)免疫复合物与B细胞表面Fc受体结合，表现为荧光阳性。为此，有人建议用荧光标记抗F(ab)2抗体染色，以排除Fc受体被着染。

　　近年来由于抗B细胞表面特异分子(CD19、CD20等)单克隆抗体的问世，因而人们开始倾向于应用荧光素标记的抗CD19或CD20的单克隆抗体直接与外周血淋巴细胞反应;或用抗CD19和CD20的单克隆抗体(第一抗体)先与淋巴细胞反应，再与荧光素标记的兔或羊抗鼠IgG(第二抗体)结合，荧光显微镜下计数或流式细胞术来计数外周血B淋巴细胞。